Uvoľňovanie a charakterizácia biologicky aktívneho proteínu z 3D kolagénových a celulózových pien

Release and characterization of biologically active protein from 3D collagen and cellulose foams

abstract

Slovak

Úvod: V tejto práci je uvedená analýza a charakterizácia 3D poréznych pien na báze kolagénu a karboxymetylcelulózy ako nosiče biologicky aktívneho proteínu (FGF2-STAB) pre akcelerované hojenie a regeneráciu kostí. Metodika: Pomocou lyofilizácie boli pripravené jedno- a dvojzložkové porézne peny. Biomateriály použité na výrobu nosičov boli bovinný kolagén, a prášková/vláknitá karboxymetylcelulóza. Dvojzložkové nosiče pozostávali zo vzájomných kombinácii týchto biomateriálov. Pre overenie vplyvu sieťovania a prostredia prípravy na uvoľňovanie rastového faktoru niektoré typy nosičov boli sieťované v EDC/NHS, alebo pripravené namiesto ultračistej vody v PBS. Do pien bol pridaný stabilizovaný FGF-STAB a bolo sledované jeho uvoľňovanie pomocou PAGE-SDS. Morfológia pien sa analyzovala pomocou SEM, a ďalšia charakterizácia bola realizovaná pomocou botnania, hydrolytického rozpadu a enzymatickej degradácie. Výsledky: Výsledky ukázali, že najvyššiu absorpčnú kapacitu po 1 hodine mali peny sieťované pomocou EDC/NHS. V porovnaní so sieťovanými mali jednozložkové nesieťované nosiče približne dvakrát nižšiu absorpčnú kapacitu, ale stále podstatne vyššiu ako nesieťované peny pripravené v PBS. Čo sa týka hydrolytickej stability sieťované peny vykazovali najvyšší čas rozpadu (21 dní). Nesieťované nosiče sa rozpadli po 3 dňoch analýzy. Bola potrebná optimalizácia metódy na sledovanie uvoľňovania rastového faktoru. Uvoľňovanie sa sledovalo v intervaloch 15; 30; 60 min. a vyhodnocovala sa pomocou PAGE-SDS. Sieťované nosiče vykazovali postupnejšie uvoľňovanie aktívnej látky v porovnaní s ostatnými penami. Po 60 minútach stále obsahovali približne 30% pridaného proteínu. Nesieťované peny a peny pripravené v PBS uvoľnili 100% inkorporovaného proteínu po 60 minútach. Na testoch biologickej aktivity FGF2-STAB uspeli všetky výluhy z analýzy uvoľňovania. Závěr: Najvhodnejšími materiálmi pre regeneráciu a hojenie kostí sú sieťované peny z čistého bovinného kolagénu a bovinného kolagénu s práškovou karboxymetylcelulózou, ktoré vykazovali vyššiu stabilitu a postupnejšie uvoľňovanie aktívnej látky pre akcelerované hojenie. Poďakovanie: Táto práca bola podporená Technologickou agentúrou Českej republiky v rámci projektu č. TO01000309 a bola vypracovaná s podporou výskumnej infraštruktúry CzechNanoLab (ID LM2018110, MŠMT, 2020-2022), CEITEC Vysoké učení technické v Brně. FGF2-STAB bol dodávaný spoločnosťou Enantis s.r.o.

Introduction: This work presents the analysis and characterization of 3D porous foams based on collagen and carboxymethylcellulose as carriers of biologically active protein (FGF2-STAB) for accelerated healing and bone regeneration. Methodology: Using lyophilization, one- and two-component porous foams were prepared. The biomaterials used for the production of carriers were bovine collagen and powdered/fibrous carboxymethyl cellulose. Two-component carriers consisted of mutual combinations of these biomaterials. To verify the effect of cross-linking and environment on growth factor release, some types of carriers were cross-linked in EDC/NHS or prepared in PBS instead of ultrapure water. Stabilized FGF-STAB was added to the foams and its release was monitored using SDS-PAGE. The morphology of the foams was analyzed using SEM, and further characterization was performed using swelling, hydrolytic breakdown, and enzymatic degradation. Results: The results showed that foams cross-linked with EDC/NHS had the highest absorption capacity after 1 hour. Compared to the cross-linked ones, the one-component noncrosslinked carriers had an absorption capacity approximately two times lower, but still significantly higher than the noncrosslinked foams prepared in PBS. Regarding the hydrolytic stability, the crosslinked foams showed the highest disintegration time (21 days). The non-crosslinked carriers disintegrated after 3 days of analysis. Optimization of the method for monitoring growth factor release was needed. Release was monitored at intervals of 15; 30; 60 min. and was evaluated using SDS-PAGE. Crosslinked carriers showed a more continuous release of the bioactive substance compared to other foams. After 60 minutes, these foams still contained approximately 30% of the added protein. Noncrosslinked foams and foams prepared in PBS released 100% of the incorporated protein after 60 minutes. All extracts from the release assay passed the biological activity tests of FGF2-STAB. Conclusion: The most suitable materials for bone regeneration and healing are crosslinked foams made of pure bovine collagen and bovine collagen with powdered carboxymethylcellulose, which showed higher stability and more continuous release of the active substance for accelerated healing. Acknowledgment: This work was supported by the Technology Agency of the Czech Republic within the project no. TO01000309 and was developed with the support of the research infrastructure CzechNanoLab (ID LM2018110, MŠMT, 2020-2022), CEITEC University of Technology in Brno. FGF2-STAB was supplied by Enantis s.r.o.

Regeneratívna medicína, kolagén, karboxymetylcelulóza, nosič, uvoľňovanie, fibroblastový rastový faktor, PAGE-SDS

Regenerative medicine, collagen, carboxymethylcellulose, scaffold, release, fibroblast growth factor, PAGE-SDS

IZSÁK, D.; KACVINSKÁ, K.; ŽÍDEK, J.; KUTÁLKOVÁ, K.; VOJTOVÁ, L.

8. 12. 2022

České vysoké učení technické v Praze

Praha

978-80-01-07052-9

Laboratorní a klinické aspekty regenerativní medicíny

1.

79

79

79

http://symma.cz/regmed/