Polimerizációra képes flagellin alapú kötőfehérjék előállítása

Production of flagellin-based binding proteins capable of polymerisation

abstract

Hungarian

A bioszenzorikában használt antitestek előállítása drága és bonyolult, de sokszor problémát jelent nem megfelelő stabilitásuk is. Csoportunk egyik fő célkitűzése a hagyományos antitestek kiváltása olyan flagellin alapú fúziós kötőfehérjék létrehozásával, amelyekből polimerizációs képességük révén filamentáris nanoszerkezetek építhetők. A baktériumok flagelláris filamentumai a flagellin fehérje több tízezer kópiájából épülnek fel. A flagellin polipeptidláncának középső részét a filamentumok felületén elhelyezkedő D3 domént alkotja, mely a filamentáris szerkezet kialakításában nem játszik szerepet. Ebben a munkában különféle célmolekulák specifikus megkötésére képes egydoménes antitesteket építettünk be a polimerizációs képesség megzavarása nélkül a flagellin D3 doménjének helyére. Az egydoménes antitestek flagellin belsejébe illesztéséhez megfelelő összekötő szegmensek alkalmazására van szükség. Az optimális linkerek kiválasztása érdekében sokféle linkerpárral végeztük el az egydoménes antitestek beépítését, majd az elkészített fúziós konstrukciókat flagellin deficiens szalmonella gazdasejtekkel termeltettük, s végül a célmolekulákkal funkcionalizált mágneses mikrorészecskékkel a sejtkultúrából kihalásztuk azokat a sejteket, amelyek felületükön kötő tulajdonságú filamentumokat növesztenek. Többféle biofizikai módszerrel demonstráltuk, hogy a kötőfehérjék beépítése a flagellin belsejébe számottevően nem befolyásolja a specifikus ligandum iránti affinitásukat.

The preparation of antibodies used for biosensors is expensive and complicated and a problem often is insufficient stability. Main objective of this study is to produce flagellin-based binding proteins capable of polymerization. The helical filaments of bacterial flagella extend over the surface of the cell membrane and are made of several tens of thousands copies of the flagellin protein. The middle portion of the polypeptide chain of the flagellin D3 domain located on the surface of filaments is not required for filament formation. In this work, a variety of target molecules able to bind specific single domain antibodies have been incorporated in the polymerization capacity without disrupting the D3 domain of flagellin place. Inside the single domain antibodies connecting segments is necessary to use . In order to select the optimal linkers large number of fusion variants with randomly paired linker segments were designed. Several biophysical methods demonstrated that the incorporation of the proteins into the binding flagellin does not significantly affect their affinity for a specific ligand .

flagellin, Salmonella, linker

flagellin, Salmonella, linkers

KLEIN,Á.; BITTNEROVÁ, Z.; MEICZINGER, M.; MUSKOTÁL, A.; KOVÁCS, M.; TÓTH, B.; VONDERVISZT, F.

27. 8. 2013

Veszprém