Štiepenie plazmidovej DNA pomocou iónov Nd3+

Štěpení plasmidové DNA pomocí iontů Nd3+

abstrakt

slovenština

V poslednej dobe sa zvýšil záujem v navrhovaní malých kovových komplexov, ktoré sú schopné katalytickej hydrolýzy deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) a ribonukleovej kyseliny (RNA) .[1] Väčšina známych syntetických katalyzátorov pre DNA hydrolýzu sú kovové ióny a ich komplexy. Predovšetkým lanthanoidy sú známe ako výborné katalyzátory k štiepeniu DNA. Hydrolyzujú fosfodiesterové väzby na jednoduché estery fosfátu, oligonukleotidy, RNA a jednoreťazcovú DNA.[2] Hoci je známe množstvo prirodzene pôsobiacich hydroláz, vývoj syntetických nukleáz by mal veľký úžitok a význam. [1,3] Možno najväčší význam syntetických hydroláz by bolo ich použitie ako artificiálne reštrikčné enzýmy.[4,5] Je možné ich využiť i k linearizácii plazmidov [2], ktoré sa vyskytujú v klinicky významných kmeňoch baktérií vzhľadom k premenlivosti ich genómu. Cieľom práce bolo štiepenie plazmidovej DNA pUC19 (kontrola) a plazmidovej DNA izolovanej z kmeňov Staphylococcus aureus P2, Staphylococcus aureus P9, Staphylococcus aureus P12, Staphylococcus aureus P23 a Staphylococcus aureus PO7/235 pomocou iónov Nd3+. Štiepenie plazmidovej DNA prebiehalo pri 63 C a reakčný čas bol v rozmedzí 0 - 4 hodín. Reakcia bola zastavená prídavkom 0,5M EDTA. Naštiepená plazmidová DNA bola detekovaná pomocou agarózovej gélovej elektroforézy. Optimálna doba štiepenia bola 4 hodiny. U niektorých kmeňov došlo k linearizácii plazmidov iónmi neodýmia. Veľkosti fragmentov linearizovanej formy boli použité k charakterizácii (určeniu veľkosti) neznámych plazmidov, izolovaných z klinických kmeňov Staphylococus aureus. Bolo zistené, že jednotlivé kmene obsahujú 1-3 plazmidy rôznych dĺžok. Použité lanthanoidové ióny Nd3+ sa ukázali byť vhodným prostriedkom k neenzymatickému štiepeniu plazmidovej DNA. Táto práca vznikla za finančnej podpory výskumného zámeru MŠMT ČR MSM 0021622415. [1] Hegg, E.L., Burstyn, J.N.: Toward the development of metal-based synthetic nucleases and peptidases: a rationale and progress report in applying the principles of coordination chemistry. Coord. Chem. Rev.173 (1998) 133-165. [2] Rittich, B., Španová, A., Falk, M., Beneš, M., Hrubý, M.: Cleavege of double-stranded plasmid DNA by lanthanide complexes. J. Chromatogr. B 800 (2004) 169-173. [3] Franklin, S.J.: Lanthanide-mediated DNA hydrolysis. Curr. Op. Chem. Biol. 5 (2001) 201–208. [4] Radzicka,A.,Wolfenden,R. .: A proficient enzyme. Science 267 (1995) 90–93. [5] Komiyama,M., Sumaoka,J.: Progress towards synthetic enzyme sfor phosphoesterhydrolysis. Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998) 751–757.

Recently increased interest in designing small metal complexes that are capable of catalytic hydrolysis of deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA). Most of the known synthetic catalysts for DNA hydrolysis are metal ions and their complexes.[1] In particular, lanthanides are known as excellent catalysts of DNA cleavage. They hydrolyze phosphodiester bond in simple phosphate esters, oligonucleotides, RNA and single stranded DNA.[2] Although it is known quantity of natural active hydrolases, development of synthetic nucleases would be a great benefit and importance [1,3]. Perhaps the most important synthetic hydrolases could use them as artificial restriction enzymes. [4,5] It can be also used for plasmid linearization [2], which occur in clinically relevant strains of bacteria due to the variability in their genome. The aim of this work was to cleavage of plasmid DNA pUC19 (control) and plasmid DNA isolated from strains of Staphylococcus aureus P2, Staphylococcus aureus P9, Staphylococcus aureus P12, Staphylococcus aureus P23 and Staphylococcus aureus PO7/235 with Nd3 + ions. Cleavage of plasmid DNA was carried out at 63 C and reaction time ranged from 0 to 4 hours. The reaction was stopped by addition of 0.5 M EDTA. Cleaved plasmid DNA was detected by agarose gel electrophoresis. Optimal digestion time was 4 hours. Fragment sizes of linearized form were used for characterization (determining of size) of unknown plasmids isolated from clinical strains of Staphylococcus aureus. It was found that individual strains contain 1-3 plasmids of different lengths. Used lanthanide ions Nd3+ were shown to be an appropriate for nonenzymic cleavage of plasmid DNA. This work was created with financial support from the Ministry of Education research plan MSM 0021622415. [1] Hegg, E.L., Burstyn, J.N.: Toward the development of metal-based synthetic nucleases and peptidases: a rationale and progress report in applying the principles of coordination chemistry. Coord. Chem. Rev.173 (1998) 133-165. [2] Rittich, B., Španová, A., Falk, M., Beneš, M., Hrubý, M.: Cleavege of double-stranded plasmid DNA by lanthanide complexes. J. Chromatogr. B 800 (2004) 169-173. [3] Franklin, S.J.: Lanthanide-mediated DNA hydrolysis. Curr. Op. Chem. Biol. 5 (2001) 201–208. [4] Radzicka,A.,Wolfenden,R. .: A proficient enzyme. Science 267 (1995) 90–93. [5] Komiyama,M., Sumaoka,J.: Progress towards synthetic enzyme sfor phosphoesterhydrolysis. Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998) 751–757.

plazmidová DNA, Staphylococcus aureus, lantanoidové ióny, Nd3+

plasmid DNA, Staphylococcus aureus, lanthanide ions, Nd3 +

ZOVČÁKOVÁ, M.; ŠPANOVÁ, A.; PANTŮČEK, R.; DOŠKAŘ, J.; RITTICH, B.

26. 10. 2011

Masarykova univerzita

Brno

978-80-210-5594- 0

XV. Setkání biochemiků a molekulárních biologů: Sborník příspěvků

100

100

1